Razumijevanje (eko)toksikološke uloge odabranih SLC i MATE transportnih proteina zebrice (Danio rerio) korištenjem metoda funkcionalne genomike

Kategorija
Projekti Hrvatske zaklade za znanost
Šifra projekta
IP-2019-04-1147
Iznos financiranja
947 000
HRK
Datum početka
1.3.2020.
Datum završetka
29.2.2024.
Status
Aktivan

Zavod za istraživanje mora i okoliša

Različite skupine polispecifičnih membranskih prijenosnika predstavljaju integralne dijelove vrlo kompleksnog sustava stanične obrane u životinjskim stanicama1-3, a dokazi prikupljeni tijekom zadnja tri desetljeća jasno ukazuju na dva glavna tipa membranskih prijenosnika od osobite (eko)toksikološke važnosti: tzv. uptake prijenosnike (transportere) i efluks prijenosnike. Među uptake prijenosnicima, članovi tzv. SLC (solute carriers) superporodice proteina ključni su u posredovanju ulaska brojnih ksenobiotika u stanice sisavaca4,5. Nakon ulaska, koji je tipično posredovan različitim tipovima uptake prijenosnika, ksenobiotici se u većini slučajeva biotransformiraju posredstvom metaboličkih enzima faze I. i II. u vodotopne metabolite. Njihovo izbacivanje iz stanice je potom posredovano efluks prijenosnicima, pri čemu je dokazano da članovi tzv. ABC (ATP binding cassette) i MATE (multidrug and toxic compound extrusion) proteinskih porodica izbacuju ksenobiotike i štite stanice od njihova prekomjernog nakupljanja i toksičnog učinka1,5-8.

Gotovo tri desetljeća istraživanja u području toksikologije okoliša pokazala su da su analogni stanični obrambeni mehanizmi uključeni u procesiranje ksenobiotika i u vodenih organizama. Istraživanjem naše i drugih istraživačkih grupa pokazano je da posredovanje u prometu ksenobiotika u vodenih organizama uključuje regulaciju njihova unosa putem uptake prijenosnika organskih aniona i kationa9-14. Također je dobro poznato da je biotransformacija ksenobiotika u vodenih organizama posredovana enzimima faze I. i II.15-17. Konačno, posljedični metaboliti, a u određenim slučajevima i originalni spojevi, aktivno se izbacuju iz stanica putem ABC prijenosnika-20. Osim toga, naša grupa nedavno je pokazala da je nedavno prepoznata skupina efluks prijenosnika, MATE proteini, prisutna i aktivna u ribe zebrice21,22.

Međutim, unatoč značajnom napretku posljednjih godina, razumijevanje fiziološke i/ili obrambene uloge specifičnih membranskih prijenosnika u vodenih organizama velikim je dijelom ograničeno. Nekoliko je ključnih razloga za to: (1) najveći dio relevantnih istraživanja proveden je koristeći različite vrste morskih i slatkovodnih beskralješnjaka i kralješnjaka, bez fokusa na dobro definirane modelne vrste; (2) značajan dio dokaza o identifikaciji i ekspresiji prijenosnika pribavljen je samo na razini genskog transkripta, zbog neraspoloživosti specifičnih antitijela; (3) određivanja transportne aktivnosti in vitro načinjena su koristeći relativno nespecifične kombinacije modelnih supstrata i inhibitora, iako je funkcionalna važnost bilo kojeg prijenosnika u određenom tkivu ovisna o njegovoj supstratnoj specifičnosti, razini ekspresije te prisustvu/odsustvu drugih prijenosnika s preklapajućim supstratnim specifičnostima4,23,24. Konačno, (4) usporediva in vitro istraživanja realizirana u dobro definiranim i kontroliranim pokusnim uvjetima, s jednim prijenosnikom visoko eksprimiranim u pogodnim heterolognim ekspresijskim sustavima, iako karakterizirana prijeko potrebnom specifičnosti i osjetljivosti, nisu mogla po definiciji ponuditi uvjerljive dokaze o ulozi specifičnih prijenosnika in vivo, ili relevantnosti njihove inhibicije okolišnim zagađivalima u stvarnim okolišnim uvjetima19.

S obzirom na opisane nedostatke, te na temelju nedavnih opširnih istraživanja naše grupe na SLC uptake9,10,14, 25-27 i MATE efluks prijenosnicima21,22, u ovom istraživačkom projektu namjeravamo značajno unaprijediti naše razumijevanje (eko)toksikološke uloge odabranih SLC i MATE transportnih proteina koristeći metode funkcionalne genomike zebrice (Danio rerio). Pri tome ćemo koristiti zebricu kao dobro etablirani i sve važniji istraživački model u biomedicinskim i okolišnim istraživanjima, najvećim dijelom fokusirat ćemo se na uptake i efluks prijenosnike zebrice koji su nedavno in vitro karakterizirani u našoj grupi, karakterizirat ćemo in vitro i prijenosnike koji nisu evaluirani u prethodnim istraživanjima, te u konačnici probati odrediti fiziološku i/ili obrambenu ulogu odabranih prijenosnika zebrice koristeći CRISPR/Cas9 metode editiranja genoma koje su u potpunosti na raspolaganju u našem laboratoriju. U skladu s tim postavkama ovdje naglašavamo dva ključna argumenta za ovaj projektni prijedlog, koje konzistentno prevodimo u ključne ciljeve projekta:

1)         Polispecifični uptake i efluks transportni proteini djeluju kako integralni dijelovi staničnog obrambenog/detoksikacijskog sustava u sisavaca, te vrlo vjerojatno imaju slične uloge u vodenih kralješnjaka, riba općenito te analogno tome ribe zebrice. Stoga je naša hipoteza da će zebrice deficijentne s obzirom na prisustvo i ekspresiju membranskih prijenosnika od potencijalne (eko)toksikološke važnosti: (a) pokazati detektabilne promjene fenotipa tijekom embrionalnog razvoja i/ili u kasnijim razvojnim stadijima, kao posljedice promjene u transportu fiziološki važnih supstrata predmetnih prijenosnika; ili (b) se značajno razlikovati u osjetljivosti na modelne toksične spojeve u usporedbi s divljim (wild type - WT) zebricama. Stoga, koristeći se kombinacijom novih in vitro saznanja i rezultata in vivo studija s genetski deficijentnim zebricama za istraživane prijenosnike koje ćemo kreirati tijekom projekta, osigurat ćemo nove uvide kritične za razumijevanje njihove (eko)toksikološke relevantnosti;

2)         Pored značajnih sličnosti, raspoloživi podaci jasno ukazuju i na razlike između sisavaca i zebrice u pogledu identiteta relevantnih membranskih prijenosnika, razine njihove ekspresije, supstratnih preferencija i osjetljivosti na inhibitore. Prema tome, u ovom projektu pribavit ćemo temeljna saznanja važna za bolje razumijevanja uloge odabranih SLC prijenosnika te relevantnu interpretaciju pokusnih podataka dobivenih korištenjem zebrice kako važnog istraživačkog modela kralješnjaka.

Ostali suradnici

dr.sc. Jovica Lončar

dr.sc. Ivan Mihaljević

dr.sc. Jelena Dragojević

dr.sc.Nikola Maraković

dr.sc. Dean Karaica

Ova stranica koristi kolačiće

neki od tih kolačića nužni su za ispravno funkcioniranje stranice, dok se drugi koriste za praćenje korištenja stranice radi poboljšanja korisničkog iskustva.

Za više informacija pogledajte naše uvjete korištenja.

  • Kolačići koji su nužni za ispravno funkcioniranje stranice. Moguće ih je onemogućiti u postavkama preglednika.