Tijekom mitoze stanica formira diobeno vreteno koje simetrično razdvaja kromosome u dvije stanice kćeri. Diobeno vreteno sastoji se od nekoliko klasa mikrotubula, uključujući kinetohorna vlakna koja se vežu na kromosome putem kinetohora i preklapajuće ili interpolarne snopove antiparalelnih mikrotubula koji rastu iz suprotnih polova vretena. Za funkciju vretena potrebna je precizna prostorna organizacija snopova mikrotubula i kinetohora, koja je dobro opisana za metafazno vreteno. Međutim, tijekom prometafaze mikrotubuli su neravnomjerno raspoređeni na području budućeg metafaznog vretena, dok kinetohorna vlakna i preklapajući snopovi još nisu vidljivi. Središnje je pitanje kako se tijekom prometafaze neravnomjerno raspoređeni mikrotubuli preraspoređuju u dobro odijeljene i pravilno organizirane snopove koji smještaju kinetohore u metafaznu ploču. Naši početni pokusi pokazuju da se broj preklapajućih snopova povećava tijekom prometafaze i da novi snopovi mogu nastati uzdužnim cijepanjem postojećih. Da bismo analizirali molekularne mehanizme nastanka snopova, razvit ćemo pristup temeljen na novim humanim staničnim linijama dobivenima CRISPR metodom, koje ćemo proučavati pomoću konfokalne i superrezolucijske mikroskopije. Da bismo identificirali ključne proteine u formiranju snopova, modificirat ćemo ekspresiju proteina kandidata: kinetohornih proteina, motornih proteina i nemotornih proteina koji povezuju mikrotubule. Razvit ćemo i optogenetički pristup za uklanjanje proteina iz vretena, kao i pristup temeljen na bioaktivnim peptidima koji mijenjaju brzinu motornih proteina. Također ćemo identificirati mjesta nastanka kinetohornih vlakana i preklapajućih snopova te njihove detirozinacije, kao i vrijeme njihova formiranja i interakcije. Ovaj će projekt otkriti kako nastaju snopovi mikrotubula koji čine složenu arhitekturu zrelog metafaznog vretena.