NRF2 je čimbenik transkripcije neophodan za aktiviranje enzima Faze 2 koji su stanici potrebni za funkcionalan antioksidacijski odgovor na stres. U kontekstu kemoprevencije, NRF2 štiti zdravu stanicu od slobodnih radikala i zbog toga je koristan i stanici, i domaćinu. U kontekstu zloćudne bolesti, njegova je aktivnost korisna samo zloćudno promijenjenoj stanici. Najnoviji podatci upućuju na važnost neizravne uključenosti NRF2 u reguliranju transkripcije gena koji kodiraju enzyme (PHGHD, SHMT2) koji su, izravno ili neizravno, uključeni u nastanak pro-proliferativnog Warburgovog učinka. Ova uloga NRF2 usko je povezana s mutacijskim statusom stanice zloćudnog tumora. Kurkumin se na ove enzime može izravno vezati, i istovremeno poticati NRF, čija je aktivnost regulirana na nekoliko razina. Transkripcijska aktivnost ovisi o metiliranosti DNA njegovog promotora (ova su dva parametra negativno korelirana) i postojanju represivne trimetilacijske oznake na lizinu 27 u histonu H3 (H3K27me3). Metiltransferaza histona EZH2, odgovorna za uspostavu ove epigenetske modifikacije smatra se onkoproteinom. Međutim, njezino ispoljavanje je vrlo varijabilno, i ovisno o tipu stanice, a prognostička vrijednost kontradiktorna u nekim kliničkim modelima raka (rak pluća). Uzroci ovih razlika pokušat će se shvatiti praćenjem funkciju NRF2in vitro, u nekoliko linija stanica raka, različitog podrijetla i različitog mutacijskog statusa, u mirovanju i u uvjetima poticanja fiziološkog stresa. Ove ćemo uvjete eksperimentalno izazvati gladovanjem, primjenom kurkumina u biomodulatornim i citotoksičnim koncentracijama, i inhibitorom EZH2, EPZ-6438 (danas poznat kao Tazemetostat). Ovo su uvjeti u kojima se stanica mora aktivirati svoje mehanizme preživljenja. U kontekstu poveznica metabolizma i proliferacije, uz mjerenje slobodnih kisikovih vrsta i piruvata, prati se: a) aktivnost promotora NRF2; b) prisustvo micro-RNA 200-a i 200-b; c) prisutnosti biljega proliferacije Ki-67; d) prisutnost aktivnosti dobro znanih gena koje NRF2 izravno potiče (HO-1 i NOQ-1); c) prisustvu enzima koje NRF2 potiče neizravno, a koji su izravno ili neizravno uključeni u nastanak Warburgova učinka (PKM2, SHMT2). Razina ispoljenosti ovih proteina utječe na način njihovog višerazinskog komuniciranja i određuje fenotip stanice. S obzirom na to da čine premosnicu između metaboličkih i proliferativnih signalnih puteva, značaj njihovog ispoljavanja će se, statističkom analizom podataka dobivenih imunohistokemijom na arhivskim uzorcima tumora glave i vrata, translatirati u kliniku kako bi se povezala ne samo s biološkim osobitostima tumora, nego i u odnosu na prognozu bolesti – poglavito u odgovoru na liječenje.

Tijekom trajanja prve godine projekta ranije navedena istraživanja provodila su se na stanicama FaDu i IMR-90. Otkrivene su nove transkripcijske inačice EZH2. Ujedno je otkriveno da se transkripti NQO-1 mogu razlikovno prekrajati, neovisno o redoks-statusu stanice. U drugoj godini su se ova istraživanja nastavila na stanicama Detroit 562 i Cal-27. U ove dvije linije dokazano je postojanje još dvije transkripcijske inačice EZH2 koje su se pojavljivale tijekom gladovanja, a koje su karakterizirane sekvenciranjem. Objedinjeni rezultati analize EZH2 transkripcijskih inačica, upotpunjeni su analizom proteina, prezentirani su posterom na radionici EMBO: Epigenetics and Chromatin, 01-04.05.2019., u Heidelbergu. Analiza transkripata i proteina NRF2 i NQO1 u uvjetima blagoggladovanja  (rast u mediju s niskom konecntracijom glukoze) i iznimno snažnog gladovanja (rast u mediju bez glukoze i glutamina) također je prikazana na konferenciji EMBO: Metabolism Meets Epigenetics, posterom "Epigenetic regulation of NRF2-NQO1 axis in human head and neck-originating cancer cell lines and untransformed fibroblasts exposed to nutritional stress" u 11 mjesecu 2019. Ovim su posterom prikazani i prvi rezultati vezani uz pokuse kromatinske precipitacije, koji su nedvojbeno ukazali da se na promotorima ciljnog gena (NQO1), u uvjetima stresa gladovanjem, supresivna oznaka kromatina H3K27me3 postavlja ovisno o podrijetlu stanice. Objava dijela rezultata vezanih uz ove uvjete rasta stanica objavljen je u časopisu Cells, pod nazivom Nutritional Stress in Head and Neck Cancer Originating Cell Lines: The Sensitivity of the NRF2-NQO1 Axis.

S obzirom na to da se ovim projektom istražuje i djelovanje kurkumina koje je odlična podloga za istraživanje poveznica upale i metaboličkog reprogramiranja, dio hipoteza koje su temelj ovog projekta razradili smo u revijalnom članku "Curcumin and its Potential for Systemic Targeting of Inflamm-Aging and Metabolic Reprogramming in Cancer“, koji je objavljen u ožujku 2019.

Nastavno na ovaj pregledni rad, a u skladu s jednom od hipoteza projekta: stanice rakau kulturi, podrijetlom od različitih primarnih tumora, različito reagiraju na djelovanje kurkumina, ova je hipoteza i potvrđena te objavljena u 2020. godini:Cell-Type Specific Metabolic Response of Cancer Cells to Curcumin, u časopisu International Journal of Molecular Sciences.

Iako se kurkumin u mnogim publikacijama naziva lijekom, kurkumin nije lijek. U revijalnom radu Implementing Curcumin in Translational Oncology Research (Molecules, 2020) objedinili smo spoznaje o kurkuminu, u kontekstu njegove translacije u kliničku onkologiju. Ovaj je rad objavljen u suradnji s našim kolegama, kliničarima.

Metaboličko reprogramiranje stanice raka može se istraživati na velikom broju razina. U zadnje dvije godine je snažan naglasak stavljen na nikotinamid-N-metiltransferazu (NNMT), metabolički enzim koji katalizira metilaciju nikotinamida (NAM) koristeći univezalni donor metilne skupine, S-adenosil metionin (SAM). Na ovaj način izravno povezuje metabolizam ugljika s metilacijskim statusom stanice i razinom nikotinamid adenin dinukleotida (NAD⁺). U radu Nicotinamide N-Methyltransferase in Acquisition of Stem Cell Properties and Therapy Resistance in Cancer (IJMS, 2021) razradili smo moguće mehanizme kojima aktivnost NNMT dovodi do deplecije NAD⁺ i epigenetičkog reprogramiranja. Ovo je jedan od načina na koji stanica razvija metaboličku plastičnost, izbjegava stanje senescencije i razvija osobitosti matične stanice.

Realizacijom ovog projekta otkriven velik broj transkripcijskih inačica ciljnih gena, što je bio poticaj i za dodatno bioinformatičke analize koje je proveo dr. sc. Konjevoda. Dio rezultata publiciran je u radu Relational Model of the Standard Genetic Code (ByoSytems).

Specifično ponašanje enzima fosfoglicerat dehidrogenaze (PHGDH) koji se, u uvjetima gladovanja nalazi u jezgrama stanica podrijetlom od zloćudnih tumora glave i vrata prikazano je u diplomskom radu Mije Osredečki.