Različite skupine polispecifičnih membranskih prijenosnika predstavljaju integralne dijelove vrlo kompleksnog sustava stanične obrane u životinjskim stanicama1-3, a dokazi prikupljeni tijekom zadnja tri desetljeća jasno ukazuju na dva glavna tipa membranskih prijenosnika od osobite (eko)toksikološke važnosti: tzv. uptake prijenosnike (transportere) i efluks prijenosnike. Među uptake prijenosnicima, članovi tzv. SLC (solute carriers) superporodice proteina ključni su u posredovanju ulaska brojnih ksenobiotika u stanice sisavaca4,5. Nakon ulaska, koji je tipično posredovan različitim tipovima uptake prijenosnika, ksenobiotici se u većini slučajeva biotransformiraju posredstvom metaboličkih enzima faze I. i II. u vodotopne metabolite. Njihovo izbacivanje iz stanice je potom posredovano efluks prijenosnicima, pri čemu je dokazano da članovi tzv. ABC (ATP binding cassette) i MATE (multidrug and toxic compound extrusion) proteinskih porodica izbacuju ksenobiotike i štite stanice od njihova prekomjernog nakupljanja i toksičnog učinka1,5-8.

Gotovo tri desetljeća istraživanja u području toksikologije okoliša pokazala su da su analogni stanični obrambeni mehanizmi uključeni u procesiranje ksenobiotika i u vodenih organizama. Istraživanjem naše i drugih istraživačkih grupa pokazano je da posredovanje u prometu ksenobiotika u vodenih organizama uključuje regulaciju njihova unosa putem uptake prijenosnika organskih aniona i kationa9-14. Također je dobro poznato da je biotransformacija ksenobiotika u vodenih organizama posredovana enzimima faze I. i II.15-17. Konačno, posljedični metaboliti, a u određenim slučajevima i originalni spojevi, aktivno se izbacuju iz stanica putem ABC prijenosnika-20. Osim toga, naša grupa nedavno je pokazala da je nedavno prepoznata skupina efluks prijenosnika, MATE proteini, prisutna i aktivna u ribe zebrice21,22.

Međutim, unatoč značajnom napretku posljednjih godina, razumijevanje fiziološke i/ili obrambene uloge specifičnih membranskih prijenosnika u vodenih organizama velikim je dijelom ograničeno. Nekoliko je ključnih razloga za to: (1) najveći dio relevantnih istraživanja proveden je koristeći različite vrste morskih i slatkovodnih beskralješnjaka i kralješnjaka, bez fokusa na dobro definirane modelne vrste; (2) značajan dio dokaza o identifikaciji i ekspresiji prijenosnika pribavljen je samo na razini genskog transkripta, zbog neraspoloživosti specifičnih antitijela; (3) određivanja transportne aktivnosti in vitro načinjena su koristeći relativno nespecifične kombinacije modelnih supstrata i inhibitora, iako je funkcionalna važnost bilo kojeg prijenosnika u određenom tkivu ovisna o njegovoj supstratnoj specifičnosti, razini ekspresije te prisustvu/odsustvu drugih prijenosnika s preklapajućim supstratnim specifičnostima4,23,24. Konačno, (4) usporediva in vitro istraživanja realizirana u dobro definiranim i kontroliranim pokusnim uvjetima, s jednim prijenosnikom visoko eksprimiranim u pogodnim heterolognim ekspresijskim sustavima, iako karakterizirana prijeko potrebnom specifičnosti i osjetljivosti, nisu mogla po definiciji ponuditi uvjerljive dokaze o ulozi specifičnih prijenosnika in vivo, ili relevantnosti njihove inhibicije okolišnim zagađivalima u stvarnim okolišnim uvjetima19.

S obzirom na opisane nedostatke, te na temelju nedavnih opširnih istraživanja naše grupe na SLC uptake9,10,14, 25-27 i MATE efluks prijenosnicima21,22, u ovom istraživačkom projektu namjeravamo značajno unaprijediti naše razumijevanje (eko)toksikološke uloge odabranih SLC i MATE transportnih proteina koristeći metode funkcionalne genomike zebrice (Danio rerio). Pri tome ćemo koristiti zebricu kao dobro etablirani i sve važniji istraživački model u biomedicinskim i okolišnim istraživanjima, najvećim dijelom fokusirat ćemo se na uptake i efluks prijenosnike zebrice koji su nedavno in vitro karakterizirani u našoj grupi, karakterizirat ćemo in vitro i prijenosnike koji nisu evaluirani u prethodnim istraživanjima, te u konačnici probati odrediti fiziološku i/ili obrambenu ulogu odabranih prijenosnika zebrice koristeći CRISPR/Cas9 metode editiranja genoma koje su u potpunosti na raspolaganju u našem laboratoriju. U skladu s tim postavkama ovdje naglašavamo dva ključna argumenta za ovaj projektni prijedlog, koje konzistentno prevodimo u ključne ciljeve projekta:

1)         Polispecifični uptake i efluks transportni proteini djeluju kako integralni dijelovi staničnog obrambenog/detoksikacijskog sustava u sisavaca, te vrlo vjerojatno imaju slične uloge u vodenih kralješnjaka, riba općenito te analogno tome ribe zebrice. Stoga je naša hipoteza da će zebrice deficijentne s obzirom na prisustvo i ekspresiju membranskih prijenosnika od potencijalne (eko)toksikološke važnosti: (a) pokazati detektabilne promjene fenotipa tijekom embrionalnog razvoja i/ili u kasnijim razvojnim stadijima, kao posljedice promjene u transportu fiziološki važnih supstrata predmetnih prijenosnika; ili (b) se značajno razlikovati u osjetljivosti na modelne toksične spojeve u usporedbi s divljim (wild type - WT) zebricama. Stoga, koristeći se kombinacijom novih in vitro saznanja i rezultata in vivo studija s genetski deficijentnim zebricama za istraživane prijenosnike koje ćemo kreirati tijekom projekta, osigurat ćemo nove uvide kritične za razumijevanje njihove (eko)toksikološke relevantnosti;

2)         Pored značajnih sličnosti, raspoloživi podaci jasno ukazuju i na razlike između sisavaca i zebrice u pogledu identiteta relevantnih membranskih prijenosnika, razine njihove ekspresije, supstratnih preferencija i osjetljivosti na inhibitore. Prema tome, u ovom projektu pribavit ćemo temeljna saznanja važna za bolje razumijevanja uloge odabranih SLC prijenosnika te relevantnu interpretaciju pokusnih podataka dobivenih korištenjem zebrice kako važnog istraživačkog modela kralješnjaka.